RT-PCR Kit（逆轉錄試劑盒）

產(chǎn)品說(shuō)明

RT-PCR Kit(逆轉錄試劑盒）是專(zhuān)為兩步法RT-PCR第一步實(shí)驗配制的、具有高靈敏度的RT-PCR反應系統。該系統合理配備了與cDNA第一鏈合成反應相關(guān)的各種組分，優(yōu)化的體系保證了M-MLV具有高效的逆轉錄酶活性，所得cDNA對后續的PCR或定量PCR實(shí)驗兼容性好，可用于檢測稀有基因的表達、從極少數細胞中定量檢測特定mRNA的表達水平、克隆特定基因的cDNA片段等。

M-MLV逆轉錄酶是由一個(gè)71 kD的單亞基組成的重組型DNA逆轉錄聚合酶?？梢源呋?/span>RNA或DNA：RNA雜交鏈為模板的互補DNA 的聚合反應。本酶經(jīng)修飾RNase H活性比普通的逆轉錄酶要弱很多，因此在合成第一鏈cDNA的過(guò)程中，可保證RNA的降解程度較低，從而使得率提高。

產(chǎn)品組分

R1011可進(jìn)行20次逆轉錄反應,R1012可進(jìn)行100次逆轉錄反應（20 μl 標準PCR反應體系，每次使用 M-MLV 1μl）。

M-MLV 儲存液

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)

200 mM NaCl

0.1 mM EDTA

1 mM DTT

0.01% NP-40

50% glycerol

5xfirst-strand buffer 成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)

375 mM KCl

15 mM MgCl2

50 mM DTT

質(zhì)量檢測

逆轉錄酶活性檢測

使用[32P]dCTP作為標記，200 U的 M-MLV以1μg、1.2 kb的RNA為模板進(jìn)逆轉錄反應，最低可得到120ng的cDNA，所得cDNA長(cháng)度 > 全長(cháng)的90%。

核酸外切酶活性檢測

混合50ng的標記DNA 或RNA與200U M-MLV在1×反應緩沖液體系中，37℃溫浴1 h，檢測DNA和RNA降解都不到總量的1%。

適用范圍

第一鏈cDNA 合成

cDNA文庫構建

RT-PCR

引物延伸

3'和5' RACE

注意事項

l  成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應保證全長(cháng)的完整性并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或 SDS。用于cDNA合成反應的溶液試劑盡可能用DEPC進(jìn)行處理，并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能用高壓滅菌處理時(shí)，首先用經(jīng)過(guò)滅菌的器具、水等配制溶液后，再將溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌處理。

l  為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來(lái)源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2 M同時(shí)加入4倍體積的乙醇，室溫放置3-5 min，10,000 rpm離心5 min。

l  在逆轉錄反應中經(jīng)常加入RNase抑制劑（RNasin）以增加cDNA合成的長(cháng)度和產(chǎn)量。在第一鏈合成反應中，RNase抑制劑在緩沖液和還原劑（如 DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過(guò)程會(huì )使抑制劑變性，從而釋放出RNase。但是RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C 對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了RNase抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

l  較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開(kāi)，增加反應的產(chǎn)量。

l  使用簡(jiǎn)單的RNA純化方法即可獲得滿(mǎn)足RT-PCR反應的RNA，但為了保證實(shí)驗的成功率，建議使用GTC法（異硫氰酸胍法）制備的高純度RNA。

l  為防止RNA降解，應盡量避免反復凍融，最好保存于-70℃。

l  最佳的PCR反應條件，因PCR擴增儀的不同而不同，所以在使用您的樣品之前最好先試做一下control反應，以確定最佳的PCR反應條件。

l  cDNA產(chǎn)物應置于-20℃保存。

l  當以cDNA為模板進(jìn)行PCR之前，使用RNase H處理cDNA，可以提高PCR反應的靈敏度。

操作步驟

1 在冰浴的無(wú)菌離心管中配制下列混合物

1-5μg RNA

1μl Oligo(dT)₁₅ 或Random primer，

補RNase-free ddH₂O至13.4μl；

2進(jìn)行變性退火反應

70℃溫浴5 min,

簡(jiǎn)短離心后冰浴5 min；

3在上述離心管中配制反轉錄反應液

4 μl  5×first-strand buffer

1 μl  dNTPs（10 mM each）

0.6μl  RNasin ,

1 μl   M-MLV；

4按下列條件進(jìn)行反轉錄反應

Oligo (dT)₁₅ ：42℃溫浴60 min；

Random primer： 37℃溫浴60 min。

5終止反應

70℃溫浴5 min終止反應，置冰上進(jìn)行后續實(shí)驗或-20℃保存。

6用RNase-free ddH₂O將反應體系稀釋到50μl，取2-5μl進(jìn)行PCR擴增反應。